Air pollution is believed to be one of the main factors contributing to forest decline. There is growing evidence that ozone, the concentration of which is continuously increasing and in many European region exceeds the threshold of toxicity for sensitive species, is involved in the genesis of this phenomenon. Recently, the similarities between O3-induced responses and the hypersensitive reactions induced by a pathogen attack, led to the suggestion that O3 phytotoxicity could be the consequence of a cascade of events regulated by signalling molecules, interacting with each others in a rather complex manner and ultimately leading to the induction of defense responses or cell death. The present work was addressed at investigating the mechanisms of O3 perception and some early responses carried out by the plant cell in an attempt to counteract its effects. Two poplar clones showing different sensitivity towards the pollutant as far as visible symptoms are concerned (I-214 O3-resistant and Eridano O3-sensitive) were used as a model system. The obtained data let us to hypothesize that the major sensitivity shown by Eridano could derive from a marked H2 O2 accumulation and increase in salicylic acid content and ethylene evolution which were more pronounced than in I-214. Thus, the O3-induced damage could be the consequence of an abnormal uncontrolled induction of metabolic pathways usually involved in the defensive response, the exaggerated and prolonged stimulation of which could lead to cell death.
Nei primi anni ’80 la preoccupazione generata dalla drammatica perdita di vitalità di molte aree forestali in Europa e nel Nord America, associata alla crescente consapevolezza dell’importanza degli ecosistemi forestali sia da un punto di vista ecologico che economico, ha gettato le basi per una serie di studi volti a ricercare le cause responsabili del cosiddetto “forest decline”. Questo fenomeno viene sempre più spesso messo in correlazione con i danni indotti dall’inquinamento atmosferico (
Gli ecosistemi forestali sono caratterizzati da un’elevata complessità. Il monitoraggio dello stato di salute di una foresta necessita quindi dell’integrazione di analisi condotte su più livelli, a partire dall’ecosistema nel suo complesso sino ad arrivare al tessuto fogliare e alla singola cellula.
Il nostro lavoro ha previsto l’impiego di due cloni di pioppo con diversa sensibilità nei confronti dell’O3, in termini di sintomatologia fogliare, (clone I-214, O3-resistente, e clone Eridano, O3-sensibile) come sistema modello per indagare i meccanismi attraverso i quali la pianta percepisce il fattore di disturbo rappresentato dall’O3 e per studiare le reazioni precoci di risposta messe in atto nel tentativo di contrastarne gli effetti. A questo scopo le talee sono state fumigate con 150 nl l-1 di O3 in un esperimento della durata di 5 ore, effettuato in condizioni controllate di luce, temperatura e umidità relativa. Questo tipo di esposizione, pur rappresentando una situazione poco naturale e una evidente esemplificazione del complesso fenomeno responsabile del
La risposta di una pianta all’ozono dipende da una serie di eventi che hanno inizio con l’assorbimento dell’inquinante, cui fanno seguito alterazioni o danni metabolici a carico della cellula vegetale la cui entità dipende, oltre che dalle condizioni ambientali, dalla sensibilità delle specie all’inquinante. La quantità di O3 assorbita dai tessuti vegetali gioca un ruolo chiave nel determinare gli effetti sul metabolismo e sulla fisiologia della pianta. L’assorbimento è principalmente regolato dalla velocità degli scambi gassosi a livello di foglia, anche se altri fattori operanti a diversi livelli possono contribuire alla regolazione (
Una volta penetrato all’interno della cavità sottostomatica, l’ozono si decompone rapidamente nella fase acquosa della matrice apoplastica dando origine ad una serie di specie reattive dell’ossigeno (ROS), quali l’anione radicale superossido (O2 -), il radicale idrossilico (OH-) ed il perossido di idrogeno H2 O2 (
Mentre un’esposizione di tipo cronico, cioè una prolungata esposizione a basse concentrazioni dell’inquinante, determina effetti molto simili a quelli provocati da una senescenza precoce, un’esposizione di tipo acuto, caratterizzata da alte concentrazioni dell’inquinante somministrate per brevi periodi, induce risposte d’ipersensibilità (HR) analoghe a quelle attivate in seguito all’attacco di fitopatogeni (
Al termine delle 5 ore di esposizione all’ozono tale sintomatologia era distintamente visibile solo nel clone Eridano sotto forma di lesioni puntiformi che, nell’arco delle 24 ore successive alla fine della fumigazione, subivano un progressivo ampliamento che culminava nella formazione di estese aree necrotiche (
La comparsa di sintomi visibili sulla superficie fogliare rappresenta la manifestazione macroscopica di una serie di eventi e modificazioni che si realizzano a livello cellulare e che si concludono con la morte della cellula stessa. A conferma della perdita dell’integrità di membrana, l’utilizzo del colorante vitale Evan’s blue, al quale le membrane cellulari risultano impermeabili, ha evidenziato ampie regioni caratterizzate dalla presenza di cellule blu nei dischetti prelevati dalle piante del clone Eridano trattate con O3, il cui numero aumentava in modo apprezzabile nelle 24 ore successive alla fine dell’esposizione. In analogia a quanto osservato a livello macroscopico, nei dischetti prelevati dalle foglie del clone I-214 non erano evidenti cellule danneggiate, ad eccezione della comparsa di alcune cellule colorate in blu durante il periodo di osservazione successivo alla fumigazione (
Recentemente, le somiglianze riscontrate tra le risposte indotte dall’ozono e la risposta ipersensibile osservata nell’interazione incompatibile pianta-patogeno hanno suggerito che l’ozono possa comportarsi alla stregua di un elicitore fungino. In quest’ottica gli effetti dell’ozono si esplicherebbero attraverso una cascata di eventi regolati dall’induzione di molecole segnale che medierebbero la stimolazione di risposte secondarie a livello genico, metabolico ed ormonale. Le ROS, in particolare l’H2O2, così come l’acido salicilico, l’acido jasmonico e l’etilene, entrambi prodotti precocemente in seguito all’esposizione all’inquinante, sembrano essere ottimi candidati nel mediare l’elicitazione degli effetti diversificati che costituiscono la reazione delle piante all’O3 (
Durante l’ultimo decennio, l’H2O2 è stata oggetto di crescente attenzione a causa del suo duplice ruolo come molecola segnale e come composto tossico promotore di danni ossidativi a carico della struttura cellulare (
Nelle foglie del clone sensibile Eridano, la localizzazione citochimica dell’H2O2 mediante microscopia elettronica ha rivelato numerosi ed evidenti precipitati, localizzati prevalentemente nelle cellule del tessuto a palizzata in prossimità degli spazi intercellulari (
L’accumulo di H2O2 a livello apoplastico in piante esposte ad O3 nonché una stretta connessione tra la produzione di questa ROS e la sensibilità all’inquinante sono ampiamente testimoniati in letteratura da studi condotti su numerose specie vegetali, tra cui betulla (
L’origine delle ROS conseguente alla presenza di O3 non è ancora stata completamente chiarita. In aggiunta alla decomposizione spontanea dell’O3 nell’apoplasto (
Benché l’importanza dell’H2O2 nel ruolo di molecola segnale sia ampiamente riconosciuta, è opportuno ricordare che la sua concentrazione deve essere accuratamente tenuta sotto controllo da parte della cellula per evitare l’insorgenza di danni ossidativi. Dal momento che i livelli di H2O2 necessari ad indurre i geni di difesa risultano meno elevati di quelli richiesti per innescare la morte cellulare (
L’ascorbico perossidasi (APX), in virtù della sua elevata affinità per l’H2O2 e della sua presenza in numerosi compartimenti cellulari, rappresenta uno dei sistemi più efficaci nella detossificazione delle ROS (
L’attiva produzione di ROS da parte della cellula vegetale, il cosiddetto “burst ossidativo”, sarebbe parte della complessa strategia di difesa attuata dalla pianta in risposta alla presenza di O3 che vede coinvolta l’H2O2 come molecola messaggero a breve distanza, in virtù della sua capacità di attraversare le membrane e diffondere alle cellule vicine e di reagire con componenti di membrana e di parete generando altri composti a loro volta capaci di agire come segnali intra o extracellulari (
Una stretta correlazione tra l’emissione di etilene e la sensibilità all’O3, in termini di comparsa di lesioni fogliari, è stata evidenziata da più autori sia in specie erbacee che in piante arboree (
Alla luce dell’insieme dei risultati ottenuti è possibile ipotizzare che la maggior sensibilità all’O3 manifestata dal clone Eridano in termini di sintomatologia fogliare sia imputabile al consistente incremento del contenuto di molecole che partecipano alla catena di trasduzione del segnale di stress. Il danno che la pianta subisce sarebbe quindi la conseguenza di un’esplosione abnorme, non più controllata, di vie metaboliche normalmente indirizzate verso la difesa, ma che potenziate in modo esagerato e persistendo probabilmente ben oltre la fine dell’esposizione all’O3, porterebbero alla morte della cellula. Come già accennato, non si deve infatti dimenticare che la risposta all’O3 è un evento altamente regolato che dipende dall’interazione di numerose molecole coinvolte in una molteplicità di vie di segnalazione che comunicano tra di loro in maniera assai complessa, determinando effetti sinergici o antagonisti in funzione non soltanto del tipo di molecole coinvolte ma anche della loro concentrazione e del momento della loro produzione (
Tra i molteplici interrogativi tuttora irrisolti rimane ancora da chiarire se, nonostante la diversa tipologia di effetti determinati da esposizioni all’inquinante di tipo acuto e di tipo cronico, i meccanismi che determinano la risposta della pianta ad un’esposizione prolungata all’O3 siano sostanzialmente analoghi a quelli descritti sopra. È inoltre utile ribadire come la definizione dell’esatto ruolo giocato dall’ozono nel deperimento forestale necessiti di un approccio interdisciplinare, che preveda indagini a livelli gerarchici crescenti (dalla cellula alla foresta), affinché i risultati ottenuti in condizioni controllate possano essere convalidati da studi svolti a livello di ecosistema naturale, dove molteplici fattori di stress si sommano agli effetti dell’O3 nel determinare lo stato di sofferenza delle foreste.
Lesioni fogliari indotte da in due cloni di pioppo con diversa suscettibilità all’O3, clone I-214, tollerante (di sopra), e clone Eridano, sensibile (di sotto); a sinistra i controlli, al centro le foglie dopo 5 ore di esposizione a 150 nl l-1 di O3, adestra dopo 24 ore.
Danno cellulare indotto da 5 ore di esposizione a 150 nl l-1 di O3 in due cloni di pioppo con diversa suscettibilità all’O3, clone I-214, tollerante, e clone Eridano, sensibile, stimato mediante la permeabilità delle plasmamembrane al colorante Evan’s blu.
Modello semplificativo del processo di trasduzione del segnale di stress rappresentato dall’ozono in cui si evidenzia il ruolo delle ROS, dell’etilene e dell’acido salicilico come molecole messaggero responsabili dell’induzione della risposta delle piante all’O3.
Localizzazione citochimica
Rappresentazione schematica dell’andamento temporale di alcune risposte indotte da 5 ore di esposizione a 150 nl l-1 di O3 in due cloni di pioppo con diversa suscettibilità all’O3, clone I-214, tollerante, e clone Eridano, sensibile.