Introduzione 

Gli equilibri tra la quantità di carbonio presente nell’atmosfera, e quella immagazzinata nella biosfera e nei combustibili fossili potrebbero essere profondamente alterati a causa dell’aumento progressivo del rilascio di carbonio da questi ultimi nell’atmosfera ([24]). L’accumulo di CO₂ nell’atmosfera sarebbe anche più veloce se oceani ed ecosistemi terrestri non assorbissero una parte di quella emessa ([28], [18]). Quantificare la CO₂ assorbita da questi “sinks” potrebbe fornire utili informazioni sul ciclo del carbonio. Recenti studi suggeriscono che le piante terrestri, potrebbero fornire questa opportunità grazie al potere che hanno di alterare profondamente il segnale isotopico della CO₂ atmosferica, in particolare del δ¹⁸O ([29], [12], [33], [7], [6]). Durante la fotosintesi, la CO₂ che entra nella foglia, subisce principalmente due processi: i) discriminazione in modo sistematico contro la CO₂ contenente l’isotopo dell’ossigeno più pesante (C¹⁸O¹⁶O) rispetto a quello più leggero (C¹⁶O₂), in modo che la CO₂ atmosferica risulta più arricchita in δ¹⁸O ([17]); ii) scambio parziale o totale di atomi di ossigeno, guidata dall’enzima “Carbonic Anhydrase” (CA), con l’H₂O dei cloroplasti. Tale acqua risulta evaporativamente arricchita in δ¹⁸O in confronto a quella del suolo, in quanto le molecole isotopicamente più pesanti (H₂¹⁸O) si diffondono più lentamente rispetto a quelle più leggere (H₂¹⁶O). Pertanto, la CO₂ nei cloroplasti, arricchita in δ¹⁸O dopo lo scambio con l’acqua, in parte è assimilata durante la fotosintesi e in parte (circa i 2/3) ritorna nell’atmosfera arricchendola ulteriormente in δ¹⁸O ([20]). La stima del δ¹⁸O atmosferico fatta con i modelli esistenti comporta una serie di incertezze: i) eterogeneità isotopica dell’acqua fogliare; ii) il calcolo della concentrazione di CO₂ al sito di equilibrio tra CO₂ e H₂O; iii) il tasso dell’attività catalitica dell’enzima CA. Tradizionalmente, l’acqua fogliare è sempre stata considerata isotopicamente omogenea. In passato, i primi ad aver formulato un’equazione per la stima dell’arricchimento isotopico dell’acqua fogliare sono stati Craig & Gordon ([8]). Recenti studi hanno invece dimostrato che l’acqua fogliare non è isotopicamente omogenea, dovuto all’effetto evaporativo che mescola il δ¹⁸O tra l’H₂¹⁸O più arricchita al sito di evaporazione e l’H₂¹⁸O più impoverita proveniente dal suolo ([31]). Successivamente, Farquhar & Lloyd ([11]) hanno proposto un nuovo modello che tiene conto di queste differenze. Secondo tali autori, nella foglia si formerebbe un gradiente, dovuto alla diffusione di acqua più arricchita dal sito di evaporazione, opposto alla convezione di acqua impoverita proveniente dalla nervatura fogliare. In condizioni dove c’è una rapida evaporazione, il mescolamento delle due acque con differente arricchimento può essere lento, e come risultato l’acqua estratta da foglie traspiranti è meno arricchita di quanto stimato dall’equazione di Craig-Gordon.

L’accuratezza della stima del δ¹⁸O atmosferico dipende anche dal calcolo della concentrazione di CO₂ (c_c) al sito dove avviene lo scambio degli atomi di ossigeno con l’arricchita acqua dei cloroplasti. La CO₂ nella fase di diffusione all’interno della foglia dagli spazi intercellulari (c_i) ai cloroplasti (c_c) subisce un ulteriore discriminazione riducendo ulteriormente la sua concentrazione (5-30%).

Altro motivo di incertezza nel calcolo del δ¹⁸O atmosferico è dato dalla stima della reazione di equilibrio (θ) nello scambio dell’isotopo dell’ossigeno tra CO₂ ed H₂O, catalizzata dall’enzima CA. In genere i modelli stimano che lo scambio sia quasi completo (circa 95% - [15], [30]). Tale stima è stata sempre supportata dal fatto che l’enzima CA è presente in tutte le piante e che rapidamente catalizza la reazione di equilibrio, indipendentemente dal breve periodo (frazioni di secondo) di residenza della CO₂ nelle foglie. Secondo studi recenti invece è stato dimostrato che la velocità di tale reazione dipende da diversi fattori (temperatura, specie etc. - [22]). È stato dimostrato, ad esempio, che le piante C₄ hanno una più ridotta attività dell’enzima CA rispetto alle piante C₃. Inoltre, riduzioni di temperatura di qualche grado possono incidere sull’attività della CA abbassando la percentuale di scambio tra CO₂/H₂O anche del 10-20%.

L’obiettivo di questa ricerca è stato quello di investigare i fattori che controllano il frazionamento isotopico del carbonio e dell’ossigeno durante l’attività fotosintetica in modo da poter interpretare il segnale del δ¹⁸O della CO₂ atmosferica a scala ecosistemica. In particolare, lavorando su una larga variabilità di condizioni ambientali (luce, temperatura fogliare, deficit della pressione di vapore e percentuale di ossigeno), sono stati testati: i) l’applicabilità di due modelli per la stima dell’arricchimento isotopico dell’acqua fogliare (Péclet & Craig-Gordon) e ii) il grado con il quale l’arricchimento evaporativo dell’isotopo dell’ossigeno nell’acqua fogliare si riflette in quello della CO₂ atmosferica.

Materiali e metodi 

Condizioni sperimentali

L’esperimento è stato condotto su piantine di cotone (Gossypium hirsutum) allevate in serra con controllo di temperatura e umidità (27 ± 2 °C e 40 ± 10% rispettivamente - Australian National University, Canberra, Australia). Le piantine cresciute da seme ed allevate in vaso per 6-8 settimane, sono state irrigate quotidianamente a capacità di campo e fertilizzate con Scotts Osmocote Plus (Sierra Horticultural Products, Heerlen, The Netherlands).

Misura degli scambi gassosi

Al fine di permettere alle piante di acclimatarsi, esse venivano trasferite la sera prima dell’esperimento dalla serra al laboratorio. Le misure di scambi gassosi di CO₂ ed H₂O sono state effettuate su foglie ben sviluppate, racchiuse per intero in una cuvette, mediante un Infrared Gas Analyzers (model LI-6251, Li-cor, Lincoln, NE). Il sistema di scambi gassosi utilizzato è stato precedentemente descritto da Boyer et al. ([2]) e Cernusak et al. ([5]). I parametri gassosi (conduttanza stomatica (g_s), tasso fotosintetico (A) e traspirazione fogliare (E) sono stati calcolati come descritto da Caemmerer & Farquhar ([3]).

Durante l’esperimento, le condizioni ambientali sono state alterate per indurre un’ampia variazione dell’assimilazione fotosintetica (c_c/c_a = rapporto della concentrazione di CO₂ nei cloroplasti e nell’ambiente) e del tasso di traspirazione (e_a/e_i = rapporto della pressione parziale del vapor d’acqua in aria e all’interno della foglia) e, come conseguenza, di Δ_e (Δ¹⁸O dell’acqua ai siti di evaporazione) e Δ_c (Δ¹⁸O della CO₂ nei cloroplasti), rispettivamente.

Le misure sono state effettuate a tre differenti concentrazioni di ossigeno dell’aria (2%, 21% e 40%). Per ciascun livello di ossigeno sono stati fatti variare: il deficit della pressione di vapore (VPD), in modo da ottenerne 8 differenti valori (da 8 a 28 mbar), l’intensità della luce (1200, 500 e 100 µmol m^-2 s^-1) e la temperatura (29° C e 20°C). Al contrario, la concentrazione di CO₂ dell’aria (370-380 ppm) è stata mantenuta costante per tutto l’esperimento. Prima delle misure, la foglia veniva lasciata acclimatare nella cuvette per almeno 1.5-2 ore. Dopo aver raggiunto le condizioni di stabilità, la CO₂ in uscita dalla cuvette, isotopicamente modificata, per via del processo fotosintetico, rispetto alla CO₂ dell’aria in ingresso, è stata fatta passare in successione su trappole di alcool/ghiaccio secco e su trappole di N liquido come descritto precedentemente da Caemmerer & Evans ([4]), per le successive analisi isotopiche. I campioni di CO₂ dell’aria in ingresso sono stati anch’essi intrappolati per le analisi. Stesso destino ha anche subito l’H₂O in uscita dalla camera. Alla fine di ciascuna misura di scambi gassosi, si procedeva all’estrazione dell’acqua fogliare con una procedura di distillazione sottovuoto a 60 °C, come descritto da Gan et al. ([19]).

Analisi isotopiche

La composizione di isotopi stabili di carbonio e ossigeno della CO₂ in ingresso e uscita dalla camera sono state determinate con uno spettrometro di massa Isoprime (Micromass, Manchester, UK) operante in dual inlet mode. Misure ripetute sullo stesso campione hanno mostrato una precisione dello 0.1#permil# (n = 10). La composizione isotopica dell’ossigeno è stata espressa in riferimento alla VSMOW (Vienna Standard Mean Ocean Water - rapporto ¹⁸O/¹⁶O di 2.0052 x 10^-3). La composizione isotopica dell’ossigeno nei campioni di acqua (estratta dalle foglie, di irrigazione e quella intrappolata in uscita dalla camera durante gli scambi gassosi) sono stati determinati con un spettrometro di massa Isoprime (Micromass, Manchester, UK) operante in continuous flow mode ([13]). I campioni di acqua sono stati pirolizzati a 1300 °C prima di entrare nello spettrometro. La precisione delle analisi, sulla base di misure ripetute sullo stesso campione, è risultata dello 0.3#permil# (n = 10).

Equazioni isotopiche

Di seguito vengono riportate le equazioni utilizzate nella presente ricerca per la stima del frazionamento isotopico avvenuto durante l’attività di fotosintesi. La stima dell’arricchimento isotopico dell’acqua fogliare al sito di evaporazione (Δ_e) è stato ottenuto utilizzando l’equazione di Craig & Gordon ([8]), successivamente modificata da Farquhar & Lloyd ([11]) (eqn. 1):

dove Δ_V è la composizione isotopica dell’acqua fogliare comparata con l’acqua di origine radicale, ε_k è il frazionamento isotopico che avviene durante la diffusione dagli spazi aerei intercellulari della foglia all’atmosfera, ε⁺ è l’equilibrio di frazionamento dal liquido al vapore all’interfaccia aria-acqua, ed e_a /e_i è il rapporto tra la pressione di vapore ambiente ed intercellulare ([5]). L’equazione proposta da Farquhar & Lloyd ([11]) è stata usata per predire l’arricchimento isotopico sull’intera acqua fogliare (Δ_L - eqn. 2):

dove Pe è il numero di Péclet (EL/CD).

Il calcolo della concentrazione di CO₂ (c_c) al sito dove avviene lo scambio degli atomi di ossigeno con l’arricchita acqua dei cloroplasti è stata ottenuta dalle misurazioni di discriminazione del ¹³C, usando il metodo di Evans et al. ([9]). I valori ottenuti dalle misurazioni della composizione isotopica della CO₂ in uscita dalla cuvette (Δ_obs) sono stati comparati con quelli di Δ_i, calcolati con l’equazione semplificata proposta da Farquhar & Richards ([10]) (eqn. 3):

dove Δ_i è la discriminazione modellata, Δ_obs è la discriminazione osservata, b è il frazionamento durante la carbossilazione, a_w è il frazionamento combinato durante la dissoluzione e diffusione attraverso la fase liquida, g_i è la conduttanza della CO₂ dagli spazi intercellulari ai cloroplasti, A è il tasso di assimilazione di CO₂ e c_a è la concentrazione di CO₂ atmosferica. Plottando la deviazione di Δ_obs e Δ_i, dal rapporto A /c_a si ottiene che la curva di questa relazione è proporzionale alla resistenza al trasferimento e l’intercetta è una misura del frazionamento associato alla respirazione e fotorespirazione.

La concentrazione di CO₂ nei cloroplasti (c_c) è stata calcolata come c_c = c_i - A /g_i, mentre la composizione isotopica dell’ossigeno nella CO₂ dei cloroplasti (Δ_ca) è stata calcolata riarrangiando l’equazione della discriminazione del C¹⁸OO presentata da Farquhar & Lloyd ([11]) (eqn. 4):

dove Δ_A è la discriminazione contro C¹⁸OO durante la fotosintesi, a è la discriminazione media ponderata contro C¹⁸OO per la diffusione dai cloroplasti all’atmosfera. L’equazione 4 è risolta per Δ_ca e δ_c (δ¹⁸O della CO₂ nei cloroplasti) è stata stimata nel modo seguente: δ_c = Δ_ca (1 + δ_a) + δ_a, dove δ_a è il δ¹⁸O della CO₂ nell’atmosfera.

La stima della reazione di equilibrio (θ) nello scambio dell’isotopo dell’ossigeno tra CO₂ ed H₂O, catalizzata dall’enzima CA, è stata calcolata per ciascun punto dalle misurazioni di fotosintesi ([21]) (eqn. 5):

dove Δ_ca è il valore atteso Δ_ea se la CO₂ dei cloroplasti avesse scambiato completamente l’ossigeno con l’acqua al sito di evaporazione (δ_e). Il Δ_ea è stato calcolato come (eqn. 6):

Risultati e discussione 

La stima del bilancio in δ¹⁸O della CO₂ atmosferica dipende essenzialmente dai modelli teoretici o empirici utilizzati per il calcolo di: (i) composizione isotopica dell’acqua fogliare; (ii) concentrazione della CO₂ al sito di scambio CO₂-H₂O; e (iii) grado dell’equilibrio tra CO₂-H₂O ([21]). La presente ricerca ha permesso di stimare tali fattori per una larga variabilità di condizioni ambientali (luce, temperatura fogliare, deficit della pressione di vapore e percentuale di ossigeno).

Plottando i valori misurati del δ¹⁸O dell’acqua fogliare totale (Δ_L) e quelli stimati dai modelli Péclet (Δ_L) e Craig & Gordon (Δ_e), i risultati mostrano che nonostante sia stata ottenuta una forte correlazione, entrambe i modelli tendono a sovrastimare leggermente il Δ_L misurato (Fig. 1, pannelli a-b). Questa discrepanza è principalmente dovuta alla eterogeneità isotopica dell’acqua nelle foglie traspiranti: miscuglio tra l’acqua, meno arricchita in δ¹⁸O, nelle nervature fogliari e quella più arricchita al sito di evaporazione. Ad ogni modo, il modello Péclet mostra di essere in grado di predire più accuratamente del modello Craig e Gordon l’eterogeneità spaziale dell’acqua fogliare.

Fig. 1 - Confronto tra i valori di δ¹⁸O dell’acqua fogliare totale osservati e i valori calcolati con i modelli di Péclet (Δ_L, δ¹⁸O in acqua fogliare totale) and Craig-Gordon (Δ_e, δ¹⁸O al sito di evaporazione) in piantine di cotone durante la fotosintesi in condizioni ambientali differenti (temperatura fogliare, deficit della pressione di vapore, intensità della luce e composizione dell’ossigeno). La linea tratteggiata nel grafico rappresenta la relazione 1:1. I valori di δ¹⁸O sono espressi rispetto a VSMOW (vedi testo).

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I nostri risultati hanno evidenziato che una migliore correlazione può essere ottenuta quando si esclude il contributo dell’acqua delle nervature fogliari (Fig. 1, panelli c-d). Il Δ_L misurato è stato così ricalcolato attraverso il metodo del bilancio di massa ([27], [5]), utilizzando un fattore di correzione (12.9% ± 0.46, media ± errore standard, n = 16), ottenuto separando il contributo dell’acqua nelle nervature rispetto a quello totale fogliare. Alcuni autori hanno stimato che la frazione di volume incluso nelle nervature fogliari può variare dal 10 al 30% del totale ([25], [14]). I valori massimi sono ottenuti in specie con presenza di una fitta rete di nervature primarie e secondarie. In tal caso, i valori predetti dai modelli possono discostarsi notevolmente dal valore di Δ_L misurato, generando errori anche del 20-30% sui calcoli di δ¹⁸O a livello ecosistemico. L’errore potrebbe essere maggiore, se si considera che i due modelli assumono anche che le foglie i) siano in condizioni di equilibrio e omogeneità isotopica; ii) abbiano un volume di acqua costante ([34]). L’assunzione dell’equilibrio è spesso violata, poiché nei sistemi naturali si assiste spesso a variazioni dei parametri ambientali ([23]). Pertanto, fondamentale ai fini dell’utilizzazione di questi modelli è la stima del tempo necessario per raggiungere l’equilibrio, che studi passati stimano in 1-5 ore ([14], [32]); in genere, le condizioni di equilibrio vengono raggiunte più rapidamente nel caso di foglie a lamina sottile e in situazioni dove non si hanno forti variazioni dei parametri ambientali. Ad ogni modo, nel nostro caso la correzione ha permesso al modello Péclet di ottenere una stima molto buona del Δ_L misurato e una riduzione della discrepanza con il modello Craig e Gordon. La discrepanza tra Δ_L e Δ_e è funzione diretta del tasso di traspirazione; valori minimi di discrepanza sono registrati a basso tasso di evaporazione (Fig. 1d), in quanto associati a un più largo contributo della (meno arricchita) acqua delle nervature. L’affidabilità del modello Péclet dipende non solo dalle misure di traspirazione (E), ma anche dalla misura/stima di L (distanza effettiva tra l’acqua più arricchita del sito di evaporazione e quella meno arricchita proveniente dalla nervatura). Questo termine, difficile da calcolare su basi anatomiche è stato stimato ponendo in relazione la discrepanza tra Δ_L e Δ_e ed E. I risultati hanno mostrato che L è quasi costante e non risponde alle variazioni dei parametri ambientali (Fig. 2). Il valore di 7 mm, stimato in questo caso, si discosta lievemente da quello stimato in precedenti lavori (8 mm. [1]).

Fig. 2 - Correlazione tra i valori di L (distanza effettiva tra l’acqua più arricchita del sito di evaporazione e quella meno arricchita proveniente dalla nervatura) e di traspirazione (E) con (asterischi) o senza (simboli circolari) il contributo dell’acqua impoverita delle nervature.

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L’affidabilità dei modelli dipende anche dal calcolo della c_c (concentrazione di CO₂ nei cloroplasti) necessaria alla stima del δ_c (δ¹⁸O della CO₂ nei cloroplasti). La stima di c_c è stata ottenuta da misure di discriminazioni del ¹³C, usando il metodo di Evans et al. ([9]). I risultati indicano che il valore medio della conduttanza interna della CO₂ dagli spazi intercellulari ai cloroplasti (g_i) è di 0.65 (± 0.05 S.E.) mol m^-2 s^-1 bar^-1, mentre il valore medio del rapporto c_c /c_i è di 0.89 (± 0.03 S.E.), corrispondente a una riduzione della concentrazione da c_i a c_c di circa il 10%. In letteratura si stimano riduzioni variabili dal 5% al 30%, facendo lievitare l’errore che può essere commesso nel calcolo di δ c quando la c_i è assimilata a c_c ([4], [20]). I valori di δ_c corretti per c_c sono stati poi plottati con i valori δ e (arricchimento in δ¹⁸O al sito di evaporazione), ottenendo una correlazione significativa (r = 0.84, P = 0.0001, n = 65 per T °C 29; r = 0.66, P = 0.001, n = 23 per T °C 20), come mostrato in Fig. 3. δ_c è stato correlato anche con δ_L stimato con Péclet per T °C 29 (r = 0.70, P = 0.0001, n = 65), ma la correlazione non è stata così forte come per δ_e. Questo dimostra, come in altri lavori, che δ_e è più affidabile di δ_L nella stima di δ¹⁸O, in quanto l’acqua dei cloroplasti ha una segnatura isotopica più vicina al sito di evaporazione che all’acqua fogliare totale ([16]).

Fig. 3 - Correlazione tra δ_c (δ¹⁸O della CO₂ dei cloroplasti) e δ_e (δ¹⁸O dell’acqua al sito di evaporazione) a due diverse temperature fogliari (29º C per simboli romboidali; 20º C per simboli quadrati). La linea tratteggiata rappresenta la relazione attesa se la CO₂ dei cloroplasti fosse in pieno equilibrio isotopico dell’ossigeno con l’acqua al sito di evaporazione. I valori di δ¹⁸O sono espressi rispetto a VSMOW (vedi testo).

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La stima di θ (grado della reazione di equilibrio nello scambio di atomi di ossigeno tra CO₂ ed H₂O) è stata ottenuta mediante le equazioni 5 e 6 ([21]). I valori medi sono stati di 1.10 ± 0.02 (SE, n = 65) per T °C 29 e 0.80 ± 0.02 (SE, n = 23) per T °C 20. Il valore di θ ottenuto a 29 °C, prossimo all’unità, indica lo stato di quasi completo equilibrio tra CO₂ ed H₂O come evidenziato dalla linea tratteggiata nella Fig. 3, mentre a temperatura di 20 °C, un θ di 0.8 indica uno scambio parziale. Pertanto, i risultati mostrano che il grado di equilibrio, mediato dall’enzima CA, è notevolmente sensibile alla temperatura fogliare (Fig. 3). Gillon & Yakir ([22]) hanno suggerito un valore di θ = 0.78 da utilizzare nei modelli globali, invece di un valore di 1. Tale valore medio è stato ottenuto sulla base di una misura diretta dell’attività catalitica dell’enzima CA effettuato su 52 specie appartenenti a diversi gruppi di piante sia C₃ sia C₄.

In conclusione, ignorare i fattori che influenzano il frazionamento isotopico che avviene durante l’attività di fotosintesi potrebbe determinare una sottostima del δ¹⁸O atmosferico anche del 40-50% ([7], [26]).

Ringraziamenti 

Si ringraziano i dottori Hilary Stuart-Williams e Claudia Keitel per l’assistenza con le analisi isotopiche, Peter Groeneveld e Chin Wong per l’assistenza e la costruzione del sistema per la misura degli scambi gassosi e tutto il gruppo di Environmental Biology per gli utili suggerimenti e discussioni su questa ricerca. Si ringraziano inoltre Franco Miglietta (CNR IBIMET) e il Commissario Europeo Mr. Peter che nell’ambito del Progetto Europeo MIND (Mediterranean terrestrial ecosystem and Increasing Drought), hanno autorizzato lo stage di F. Ripullone presso la Research School of Biological Sciences dell’Australian National University di Canberra (Australia).

References